1.蛋白質(zhì)鑒定:可以利用一維電泳和二維電泳并結(jié)合Western等技術(shù),利用蛋白質(zhì)芯片和抗體芯片及**共沉淀等技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定研究。
2.翻譯后修飾:很多mRNA表達(dá)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)要經(jīng)歷翻譯后修飾如磷酸化,糖基化,酶原激活等。翻譯后修飾是蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)功能的重要方式,因此對(duì)蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究對(duì)闡明蛋白質(zhì)的功能具有重要作用。
3.蛋白質(zhì)功能確定:如分析酶活性和確定酶底物,細(xì)胞因子的生物分析/配基-受體結(jié)合分析。可以利用基因敲除和反義技術(shù)分析基因表達(dá)產(chǎn)物-蛋白質(zhì)的功能。另外對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)出來后在細(xì)胞內(nèi)的定位研究也在一定程度上有助于蛋白質(zhì)功能的了解。Clontech的熒光蛋白表達(dá)系統(tǒng)就是研究蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)定位的一個(gè)很好的工具。
4.對(duì)人類而言,蛋白質(zhì)組學(xué)的研究*終要服務(wù)于人類的健康,主要指促進(jìn)分子醫(yī)學(xué)的發(fā)展。如尋找**的靶分子。很多**本身就是蛋白質(zhì),而很多**的靶分子也是蛋白質(zhì)。**也可以干預(yù)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。
在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和**機(jī)理研究中,了解人不同發(fā)育、生長(zhǎng)期和不同生理、病理?xiàng)l件下及不同細(xì)胞類型的基因表達(dá)的特點(diǎn)具有特別重要的意義。這些研究可能找到直接與特定生理或病理狀態(tài)相關(guān)的分子,進(jìn)一步為設(shè)計(jì)作用于特定靶分子的**奠定基礎(chǔ)。
不同發(fā)育、生長(zhǎng)期和不同生理、病理?xiàng)l件下不同的細(xì)胞類型的基因表達(dá)是不一致的,因此對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)的研究應(yīng)該**到細(xì)胞甚至亞細(xì)胞水平。可以利用**組織化學(xué)技術(shù)達(dá)到這個(gè)目的,但該技術(shù)的致命缺點(diǎn)是通量低。LCM技術(shù)可以**地從組織切片中取出研究者感興趣的細(xì)胞類型,因此LCM技術(shù)實(shí)際上是一種原位技術(shù)。取出的細(xì)胞用于蛋白質(zhì)樣品的制備,結(jié)合抗體芯片或二維電泳-質(zhì)譜的技術(shù)路線,可以對(duì)蛋白質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行原位的高通量的研究。很多研究采用勻漿組織制備蛋白質(zhì)樣品的技術(shù)路線,其研究結(jié)論值得懷疑,因?yàn)榻M織勻漿后不同細(xì)胞類型的蛋白質(zhì)混雜在一起,*后得到的研究數(shù)據(jù)根本無法解釋蛋白質(zhì)在每類細(xì)胞中的表達(dá)情況。雖然培養(yǎng)細(xì)胞可以得到單一類型細(xì)胞,但體外培養(yǎng)的細(xì)胞很難模擬體內(nèi)細(xì)胞的環(huán)境,因此這樣研究得出的結(jié)論也很難用于解釋在體實(shí)際情況。因此在研究中首先應(yīng)該將不同細(xì)胞類型分離,分離出來的不同類型細(xì)胞可以用于基因表達(dá)研究,包括mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)。
LCM技術(shù)獲得的細(xì)胞可以用于蛋白質(zhì)樣品的制備。可以根據(jù)需要制備總蛋白,或膜蛋白,或核蛋白等,也可以富集糖蛋白,或通過去除白蛋白來減少蛋白質(zhì)類型的復(fù)雜程度。相關(guān)試劑盒均有廠商提供。
蛋白質(zhì)樣品中的不同類型的蛋白質(zhì)可以通過二維電泳進(jìn)行分離。二維電泳可以將不同種類的蛋白質(zhì)按照等電點(diǎn)和分子量差異進(jìn)行高分辨率的分離。成功的二維電泳可以將2000到3000種蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。電泳后對(duì)膠進(jìn)行高靈敏度的染色如銀染和熒光染色。如果是比較兩種樣品之間蛋白質(zhì)表達(dá)的異同,可以在同樣條件下分別制備二者的蛋白質(zhì)樣品,然后在同樣條件下進(jìn)行二維電泳,染色后比較兩塊膠。也可以將二者的蛋白質(zhì)樣品分別用不同的熒光染料標(biāo)記,然后兩種蛋白質(zhì)樣品在一塊膠上進(jìn)行二維電泳的分離,*后通過熒光掃描技術(shù)分析結(jié)果。
膠染色后可以利用凝膠圖像分析系統(tǒng)成像,然后通過分析軟件對(duì)蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行定量分析,并且對(duì)感興趣的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行定位。通過專門的蛋白質(zhì)點(diǎn)切割系統(tǒng),可以將蛋白質(zhì)點(diǎn)所在的膠區(qū)域進(jìn)行**切割。接著對(duì)膠中蛋白質(zhì)進(jìn)行酶切消化??酶切后的消化物經(jīng)脫鹽/濃縮處理后就可以通過點(diǎn)樣系統(tǒng)將蛋白質(zhì)點(diǎn)樣到特定的材料的表面(MALDI-TOF)。*后這些蛋白質(zhì)就可以在質(zhì)譜系統(tǒng)中進(jìn)行分析,從而得到蛋白質(zhì)的定性數(shù)據(jù);這些數(shù)據(jù)可以用于構(gòu)建數(shù)據(jù)庫(kù)或和已有的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較分析。
LCM-二維電泳-質(zhì)譜的技術(shù)路線是典型的一條蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)路線,除此以外,LCM-抗體芯片也是一條重要的蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)路線。即通過LCM技術(shù)獲得感興趣的細(xì)胞類型,制備細(xì)胞蛋白質(zhì)樣品,蛋白質(zhì)經(jīng)熒光染料標(biāo)記后和抗體芯片雜交,從而可以比較兩種樣品蛋白質(zhì)表達(dá)的異同。Clontech*近開發(fā)了一張抗體芯片,可以對(duì)378種膜蛋白和胞漿蛋白進(jìn)行分析。該芯片同時(shí)配合了抗體芯片的全部操作過程的重要試劑,包括蛋白質(zhì)制備試劑,蛋白質(zhì)的熒光染料標(biāo)記試劑,標(biāo)記體系的純化試劑,雜交試劑等。
對(duì)于蛋白質(zhì)相互作用的研究,酵母雙雜交和噬菌體展示技術(shù)無疑是很好的研究方法。Clontech開發(fā)的酵母雙雜交系統(tǒng)和NEB公司開發(fā)的噬菌體展示技術(shù)可供研究者選用。
關(guān)于蛋白質(zhì)組的研究,也可以將蛋白質(zhì)組的部分或全部種類的蛋白質(zhì)制作成蛋白質(zhì)芯片,這樣的蛋白質(zhì)芯片可以用于蛋白質(zhì)相互作用研究,蛋白表達(dá)研究和小分子蛋白結(jié)合研究。Science,Vol. 293,Issue 5537,2101-2105,September14,2001發(fā)表了一篇關(guān)于酵母蛋白質(zhì)組芯片的論文。該文主要研究?jī)?nèi)容為:將酵母的5800個(gè)ORF表達(dá)成蛋白質(zhì)并進(jìn)行純化點(diǎn)樣制作芯片,然后用該芯片篩選鈣調(diào)素和磷脂分子的相互作用分子。
*后有必要指出的是,傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)研究注重研究單一蛋白質(zhì),而蛋白質(zhì)組學(xué)注重研究參與特定生理或病理狀態(tài)的所有的蛋白質(zhì)種類及其與周圍環(huán)境(分子)的關(guān)系。因此蛋白質(zhì)組學(xué)的研究通常是高通量的。適應(yīng)這個(gè)要求,蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)研究工具通常都是高度自動(dòng)化的系統(tǒng),通量高而速度快,配合相應(yīng)分析軟件和數(shù)據(jù)庫(kù),研究者可以在*短的時(shí)間內(nèi)處理*多的數(shù)據(jù)。